p65基因序列shRNA慢病毒载体构建及其作用功能的初步研究

作者： 黄海 ; 杜涛 ; 黄健 ; 林天歆 ; 张彩霞 ; 董文 ; 尹心宝 ; 郭正辉 ; 许可慰 ; 江春 ; 韩金利

摘要：目的 建立稳定阻断前列腺癌细胞株LNCaP中核因子NF-κB（p65）表达的shRNA序列,构建慢病毒载体,检测p65在前列腺癌细胞中的作用功能.方法 根据p65基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3针对p65基因cds区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补单链DNA将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中转染前列腺癌细胞,采用RTPCR方法检测不同序列片断对p65 mRNA的抑制效率,免疫印迹方法检测其对p65蛋白表达的抑制效率.将获得的慢病毒载体感染LNCaP细胞,设对照组、空转组.采用MTT、流式细胞术、Transwell等方法检测p65的生物学作用.结果 设计的3条针对p65序列中,第3条序列对前列腺癌细胞株中p65 mRNA的干扰效率为59%,对蛋白表达的抑制率达81%.目的序列位于p65（NM_021975）的1096～1113,茎环序列为5＇-GATCC GCCCTATCCCTTTACGTCATTCAAGAGAT-GACGTAAAGGGATAGGGCTTTTTG-3＇.转染细胞后,细胞可以稳定低表达p65.MTT检测实验组细胞96 h内未出现对数增殖,生长能力低于对照组和空转组.流式细胞检测实验组G0～G1期细胞百分率为61.49%,高于对照组的44.89%和空转组的41.52%;而S期细胞百分率为28.58%,低于对照组的47.36%和空转组的46.10%,差异有统计学意义（P＜0.05）.Transwell检测实验组透过细胞数为（16.5000±6.62076）个,低于对照组和空转组[（45.6333±13.54159）个,（36.8333±5.68412）个],差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 成功获得稳定阻断前列腺癌细胞株LNCaP中p65表达的shRNA序列,并构建慢病毒载体;初步验证了p65在前列腺癌细胞增殖、侵袭和转移中的促进作用.

关键字： 前列腺肿瘤    癌    核因子κB      

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